PCR實(shí)驗(yàn)原理介紹
發(fā)表時(shí)間：2021-05-27
PCR實(shí)驗(yàn)概述
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測(cè)核酸分子的定性方法，而且也是一個(gè)能對(duì)核酸分子進(jìn)行定量的有力工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實(shí)時(shí)定量PCR (real-timequantitative PCR)技術(shù)便是一種具有意義的定量PCR技術(shù)。所謂實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。
PCR實(shí)驗(yàn)原理介紹
TaqMan熒光探針
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。
SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的大優(yōu)點(diǎn)就是可以與引物、模板相配合，用于反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，它也比其它的探針的價(jià)格要便宜得多。但由于它能與的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，那它就會(huì)影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。
步驟如下：
1. 設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. 客戶樣品RNA抽提
實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4. RNA質(zhì)量檢測(cè)
a. 紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純度
b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。
5. 使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：
進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動(dòng)聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。
8. 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量
